Как сделать доступнее реакцию лигирования на ДНК-шаблонах

Химические превращения, направляемые молекулами нуклеиновых кислот, находят применение в самых разных областях — от синтеза нанопроводов до скрининга лекарств и диагностики. В частности, одним из важнейших примеров превращений такого рода является реакция лигирования (не путать с легированием в материаловедении и лигированием в биохимии; лигирование в молекулярной биологии подразумевает сшивку двух молекул с образованием новой ковалентной химической связи под чутким руководством ДНК-молекул).

Основная трудность таких превращений заключается в необходимости использования сравнительно больших количеств вполне определённых последовательностей ДНК, достать которые из биологических источников совсем не просто. Живые организмы производят самый минимум генетического материала строго конкретного вида, да и тот может быть не вполне однородным по своей природе.

Проблему доступности нуклеиновых кислот решает полимеразная цепная реакция (ПЦР), экспериментальный метод молекулярной биологии. ПЦР использует фермент полимеразу для копирования темплатов (шаблонов) — небольших фрагментов ДНК, позволяя добиться значительного увеличения концентрации таких темплатов в биологическом материале с высокой точностью и эффективностью (это процесс назван амплификацией).

Направляемое ДНК-лигирование с образованием полипепдидной цепи в условиях одновременного протекания полимеразной цепной реакции (иллюстрация RCS).

Биохимики из Берлинского университета Гумбольдта (Германия) использовали природное химическое лигирование (ПХЛ), позволяющее получать длинные полипептидные цепи. ПХЛ — быстрый химиоселективный процесс, толерантный к присутствию различных функциональных групп. Для осуществления своей задумки учёные привязали нужные для лигирования функциональные фрагменты к ДНК, получив пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК), которые способны распознавать и связываться с ДНК-темплатами, обеспечивая необходимую близость реактантов для запуска желаемой реакции лигирования (на поверхности ДНК). Стоит отметить, что в отсутствие ДНК-темплатов лигирования ПНК-молекул не происходит. (В общем, ничего нового тут нет; всё это было известно, однако...)

Напомним ещё раз: лигирование, направляемое молекулами ДНК, требует значительного числа нуклеиновых темплатов. Всё дело в том, что по мере роста цепи продукта лигирования его связывание с имеющимися темплатами становится всё прочнее, пока не наступает момент, когда не остаётся ни одного свободного для реакции темплата. Этот феномен известен как «ингибирование продуктом». Поэтому для продолжения лигирования необходимо добавлять всё больше и больше драгоценных темплатов.

Вот тут-то мы и возвращаемся к амплификации. Основное достижение немецких учёных заключается, по сути, в простой идее — объединении описанной выше реакции ПХЛ с ПЦР-амплификацией. И тогда становится возможным применение в качестве отправной точки самого минимума ДНК-темплатов, количество которых постоянно возобновляется внутри реакционной массы в результате протекающей параллельно полимеразной цепной амплификации. Таким образом, эффект ингибирования подавляется, и реакция лигирования идёт с куда лучшим выходом.

Подробнее о результатах исследования можно узнать из статьи, опубликованной в журнале Chemical Science.

Подготовлено по материалам Chemistry World.